Các phương pháp định tính và định lượng flavonoid
|
Luận văn:Xây dựng phương pháp định tính, định lượng Flavonoid trong nụ và lá vối Luận văn ThS. Hóa phân tích -- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Đại học Quốc gia Hà Nội, 2012 Tách được 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone (CO -1) từ nụ vối. Xây dựng được phương pháp định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học. Tìm ra được hệ dung môi định tính flavonoid bằng sắc ký bản mỏng (TLC). Tìm ra được điều kiện chạy HPLC định tính chất CO-1 từ nụ và lá vối. Xác định được flavonoid toàn phần trong lá và nụ vối của một số mẫu dược liệu vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc. Xây dựng được phương pháp định lượng CO-1 bằng HPLC. Ứng dụng phương pháp xây được trong việc định lượng các mẫu lá và nụ vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN…………..…………….……………………….…..3 1.1 Tổng quan cây vối………………………….….……………………………..3 1.1.1 Tên gọi ……………………………..……………………………………3 1.1.2 Đặc điểm thực vật………………………………………………..………3 1.1.3 Phân bố, sinh thái………………………………………………….……..3 1.1.4 Thu hái và chế biến…………………………………………...………….4 1.1.5 Thành phần hóa học……………………………………………..……….5 1.1.6 Flavonoid trong cây vối………………………………………………….7 1.1.7 Tác dụng sinh học………………………………...…………………….13 1.1.8 Ứng dụng…………………………………………...…………………..16 1.2 Các phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid ……………………...…17 1.2.1 Phƣơng pháp định tính………………………………………….………17 1.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng……………………………….……………….20 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………………………………………………26 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu……………………………………...……………….26 2.2 Nội dung nghiên cứu …………………………………………..…………..27 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………..…………….27 2.3.1 Chiết xuất, phân lập flavonoid chính………….………………………..27 2.3.2 Xác định cấu trúc chất phân lập………………………………….……..28 2.4 Xây dựng phƣơng pháp định tính trong nụ và lá vối…………………...…..28 2.4.1 Định tính bằng phƣơng pháp hóa học…………………….…………….28 2.4.2 Định tính bằng phƣơng pháp sắc ký………………………..…………..28 2.5 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối…….…….30 2.5.1 Định lƣợng flavonoid toàn phần bằng phƣơng pháp trắc quang…….…30 2.5.2 Định lƣợng flavonoid chính bằng phƣơng pháp HPLC……….…..........30 2.6 Một số đặc trƣng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả……...……………31 2.7 Thiết bị, công cụ và hóa chất, dung môi……………………………………32 2.7.1 Thiết bị, dụng cụ………………………………………………………..32 2.7.2 Hóa chất, dung môi……………………………………………………..32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………...33 3.1 Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ cây vối………………....33 3.1.1 Chiết xuất dƣợc liệu và phân đoạn…..………………………………….33 3.1.2 Phân lập flavonoid chính trong cao phân đoạn ethyl acetat…………….34 3.1.3 Xác định cấu trúc chất phân lập………………...………………………37 3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid trong lá và nụ vối……...……..41 3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học………………………...…………….41 3.2.2 Định tính bằng TLC………………………………………...…………..42 3.2.3 Định tính bằng HPLC……………………………………………..……46 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong lá và nụ vối…………..48 3.3.1 Xây dựng bằng phƣơng pháp trắc quang………………...……………..48 3.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng CO-1 bằng HPLC………...………61 KẾT LUẬN……………………………….…………………………………...…74 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………....76 PHỤ LỤCMỞ ĐẦU Cây Vối, một loại cây quen thuộc của làng quê các tỉnh Đồng Bằng bắc bộ, có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae). Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng lá và nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nƣớc uống hàng ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực. Đến nay đã có nhiều nghiên cứu về cây Vối. Thành phần hóa học chính của lá và nụ Vối gồm tinh dầu, triterpenoid và flavonoid. Theo Trung học dƣợc từ hải I (1993), tinh dầu lá vối có 27 thành phần. Vỏ cây chứa một chất triterpen nhóm ursan đã đƣợc nhận dạng là acid ursolic. Nụ vối có nhiều thành phần hóa học đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc hóa học, chủ yếu là các flavonoid. Thành phần hóa học chính trong nụ vối là flavonoid, với khoảng hơn 20 flavonoid khác nhau. Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn có cấu trúc hóa học C6-C3-C6, thƣờng gặp nhiều trong thực vật. Đến nay, số lƣợng flavonoid từ thực vật đã đƣợc tìm thấy lên tới trên 8150 flavonoid khác nhau. Các flavonoid có nhiều tác dụng sinh học quý nhƣ chống ung thƣ, chống dị ứng, chống co giật, giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm... Do đó, chúng đƣợc dùng nhiều trong các ngành công nghiệp dƣợc phẩm, thực phẩm, và mỹ phẩm, phục vụ lợi ích của con ngƣời. Các flavonoid của lá và nụ vối cũng đã đƣợc chứng minh có nhiều tác dụng sinh học quan trọng nhƣ chống oxy hóa, chống ung thƣ, ức chế một số enzym (xanthin oxydase, α-glucosidase, maltase, acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase). Đặc biệt, một số chất một hợp chất có tác dụng đối với ung thƣ nhƣ 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone, 3,5',3'- trihydroxy-6,7,4'-trimethoxy flavon; 3,3'-dihydroxy-5,6,7,4'-tetramethoxy flavon. Do đƣợc sử dụng nhiều để làm trà uống và làm thuốc trong y học dân gian nên cần thiết phải có tiêu chuẩn cho nguyên liệu lá và nụ vối. Trong dự thảo Dƣợc Điển Việt Nam V (dự kiến xuất bản năm 2013-2014) đã có chuyên luận về lá và nụ vối. Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chƣa có tiêu chí về định tính và định lƣợng flavonoid trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng quan sinh học trọng. Với thực trạng trên, chúng tui đề xuất thực hiện đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu nụ và lá vối phục vụ việc quản lý chất lƣợng dƣợc liệu trên thị trƣờng. Các mục tiêu của đề tài gồm có: • Phân lập đƣợc một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lƣợng flavonoid. • Xây dựng đƣợc quy trình định tính và định lƣợng flavonoid trong dƣợc liệu nụ và lá vối. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây vối 1.1.1 Tên gọi - Tên tiếng Việt: Cây vối, vối nhà - Tên Latin: Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry - Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb. - Họ Sim (Myrtaceae). 1.1.2 Đặc điểm thực vật Cây vối là loại cây gỗ nhỡ, cao 5-10 m, có khi hơn, vỏ thân nứt nẻ, màu nâu đen. Cành nhánh có nhiều vảy, cành non tròn hay hơi hình 4 cạnh, nhẵn [3, 4, 10, 22, 42]. Lá đơn mọc đối, có cuống dài 1-1,5 cm, dai, cứng, phiến lá hình trái xoan hay hình trứng, dài 8-20 cm, rộng 5-8 cm giảm nhọn ở gốc, có mũi ngắn. Hai mặt lá có hai màu khác nhau, có nhiều tuyến mờ nâu, lá già mặt dƣới của lá có chấm nâu, gân phụ khoảng 10 cặp cách mép là 3-5 mm [3, 4, 10, 22, 42]. Hoa nhỏ màu trắng lục nhạt, gần nhƣ không cuống, hợp thành cụm hoa dạng chùy rộng, mọc ở kẽ những lá đã rụng. Nụ hoa dài, lá bắc dễ rụng. Đài dính vào bầu. Hoa đều lƣỡng tính 4 cánh hình tròn hay hình bầu dục, nhiều tuyến mờ dính lại ở đỉnh thành mũ hình chóp. Nhị nhiều xếp thành 7-9 dãy có hình bầu dục nằm sâu trong ống đài, bị nhị che kín [3, 4, 10, 22, 42]. Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đƣờng kính 7-12 mm, xù xì, khi chín có màu tím, thể chất nạc, vị ngọt [3, 4, 10, 22, 42]. Mùa hoa quả: Tháng 4 – 6 1.1.3 Phân bố, sinh thái Chi Cleistocalyx Blume gồm một số loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á. Việt Nam có 3 loài Vối là cây đặc hữu của vùng Việt Nam và Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, vối mọc tự nhiên dọc theo suối hay bờ ao hồ ở vùng núi thấp và trung du, thuộc các tỉnh Cao Bằng (Hà Quảng, Thông Nông, Thạch An…); Lạng Sơn (Đồng Mỏ, Hữu Lũng); Bắc Giang (Sơn Động, Lục Nam, Yên Thế...); Vĩnh Phúc (Lập Thạch, Tam Dƣơng); Phú Thọ, Tuyên Quang, Hà Tây, Hòa Bình….Cây vối còn đƣợc trồng rải rác trong nhân dân các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc Bộ. Vối thuộc loại cây gỗ ƣa sáng, ƣa ẩm, sinh trƣởng và phát triển nhanh; trong vòng 3 năm đầu, chiều cao thân có thể đến 5 m. Cây phân cành nhiều chồi và lá non ra nhiều trong mùa xuân, hè. Những cây mọc ở chỗ đƣợc chiếu sáng đầy đủ ra hoa quả rất nhiều, tái sinh tự nhiên từ hạt. a) Cây vối b) Nụ vối tƣơi b) Nụ vối khô ơ Hình 1.1: Hình ảnh Cây và Nụ vối 1.1.4 Thu hái và chế biến Hái lá tƣơi, phơi khô, nhƣng có ngƣời đem ủ rồi mới phơi khô, cách làm nhƣ sau: thái nhỏ, rửa sạch, cho vào thùng hay thúng ủ cho đến khi đen đều thì lấy ra rửa sạch, phơi khô. Lá vối ủ uống thơm ngon hơn. Để làm thuốc thƣờng dùng lá tƣơi phơi khô [4,10]. Nụ vối đƣợc thu hái, phơi khô dùng để pha nƣớc và làm thuốc [4, 10]. 1.1.5 Thành phần hóa học Lá Vối chứa rất ít tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều thành phần trong đó thành phần chính là (Z)-β-ocimen, myrcen, (E)-β-ocimen [3, 4, 17]. Trong lá vối có chứa flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đƣờng tự do và sterol. Vỏ cây chứa triterpen nhóm ursan là acid usolic [3]. Nụ vối chứa nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần đã xác định cấu trúc hóa học đƣợc trình bày ở Bảng 1.2. - Tinh dầu: Từ mẫu nụ vối Việt Nam, với phƣơng pháp sắc kí khí khối phổ GC/MS, Nguyễn Thị Dung và cộng sự đã xác định đƣợc 55 thành phần khác nhau có trong tinh dầu nụ vối (Bảng 1.1), gồm các monoterpen, serquiterpen và hydrocarbon serquiterpen [5]. Loại 2: Lấy (1ml) MeOH cho vào bình định mức có dung tích 10ml có chứa sẵn 4ml MeOH phân tích. Thêm vào bình 0,3 ml NaNO2 5%, sau khoảng 5 phút thêm 0,3 ml AlCl3 10 %, sau 6 phút tiếp, cho thêm 2ml NaOH 1M và sau đó thêm MeOH cho đủ 10ml. Dung dịch đƣợc trộn đều đem đo thấy cho tín hiệu. Nhận thấy nền mẫu loại 1 cho phức tan không màu khi cho các thuốc thử vào. Còn nền mẫu loại 2 thì tạo kết tủa Al(OH)3 khi cho các thuốc thử vào vì trong môi trƣờng MeOH độ tan của Al(OH)3 giảm mạnh, nên ảnh hƣởng đến việc đo quang. Do đó nền mẫu loại 1 phù hợp cho việc tiến hành phân tích xác định hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối. 3.3.1.2 Độ lặp lại của phƣơng pháp Để xác định độ lặp lại của phƣơng pháp tiến hành với 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu nụ vối Hƣng yên. Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác khoảng 1g nụ vối Hƣng yên tiến hành chiết với 25 ml MeOH làm 2 lần. Lọc, và bổ xung lƣợng MeOH cho đủ 50 ml. Sau đó đem đi đo quang, kết quả cho thấy các số liệu thống kê nằm trong điều kiện cho phép (bảng 3.4), có thể áp dụng điều kiện đã lựa chọn để định lƣợng flavonoid trong mẫu dƣợc liệu nụ và lá vối. Bảng 3.4: Kết quả độ lặp lại của phương pháp trắc quang STT 1 2 3 4 5 6 mmẫu(g) 1,0041 1,0064 1,0110 1,0365 1,0189 1,0831 Abs 0,174 0,181 0,184 0,191 0,196 0,193 Số liệu thống kê SD = 0,83.10-2 ; RSD = 4,45% Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy phƣơng pháp có độ lặp lại có thể chấp nhận đƣợc thông qua RSD = 4,45% (< 5%). 3.3.1.3 Xây dựng đƣờng chuẩn Xem link download tại Blog Kết nối! Yêu cầu Download |
